主要端粒和中期粒是最显著的染色体标志，分别标志着染色体的物理末端和动粒形成的部位。不同的重复DNA序列定义了这些区域：端粒TTAGGG重复和中期粒α-卫星（α-sat）高阶重复阵列，通常包含与特定进化上保守的核蛋白复合物相关的CENP-B盒基序，以协调每个区域的基本功能。中期粒和端粒通常占据独占的细胞核区域。除了在Schizosaccharomyces pombe的减数分裂中的特定情况外，端粒和中期粒在定义的染色体区域内的分 compartmentalization 被认为是基因组保留的必要条件。在这里，我们提供了在启用ALT机制的癌细胞中端粒–中期粒接触、中期粒重复插入以及在端粒上建立CENP-A核小体离散阵列的证据。在ALT中的端粒–中期粒接触大量端粒在前髓系白血病（PML）小体内成簇，形成ALT相关的PML小体（APBs），这在激活ALT的癌细胞中是独特的。对中期粒α-sat重复的DNA荧光原位杂交（FISH）显示，U2OS细胞中端粒和PML蛋白重叠的信号子集。在表达端粒酶（TERT +）的HeLa细胞和缺乏活性端粒延长机制的IMR90 SV40-LT表达成纤维细胞中，这些接触是缺失的。然而，在HeLa细胞中通过ASF1A和ASF1B耗竭所导致的急性ALT激活或通过破坏ATRX（α-地中海贫血/智力障碍X连锁）蛋白表达而导致的IMR90 SV40-LT细胞持续ALT激活导致重叠的中期粒–端粒–PML焦点的频率相似。对U2OS和IMR90 ATRX -缺失（KO）ALT细胞的结构照明显微镜（SIM）分析确认了端粒和中期粒DNA序列在PML小体内的紧密空间接近性。ALT端粒延伸涉及在复制压力和端粒DNA断裂刺激下的染色体间和染色体内重组及断裂诱导复制。使用Exo-FISH的分析显示频繁重叠的端粒和中期粒FISH信号在U2OS细胞中可见，但在HeLa细胞中不可见。在不同步增殖的U2OS细胞中出现了共定位的端粒–中期粒焦点的EdU掺入。在G2阶段同步后，表现出EdU掺入的细胞频率翻了一番，此时ALT活性到达最大，并且核心ALT介导因子PML、BLM和POLD3出现。因此，端粒–中期粒–PML接触是断裂诱导的复制介导的ALT机制的固有特征，这表明在ALT癌细胞中这些通常不同、被区隔的染色体区域之间可能发生不合法的重组。图1：中期粒DNA插入端粒区域。此图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整图像 a，b，U2OS中端粒、中期粒（cen）（α-sat重复）和PML的共定位的代表图像（a）和量化（b），HeLa细胞转染对照siRNA或靶向ASF1A和ASF1B的siRNA（ASF1敲低；KD），以及SV40-LT转化的IMR90细胞，无（对照）或有ATRX缺失（ATRX KO）。每条线的TMM显示为端粒酶（TERT +）、ALT +或无TMM。来自U2OS和HeLa细胞的数据使用单向方差分析（ANOVA）与Dunnett事后检验进行多重比较分析，IMR90细胞之间的比较使用无配对的双尾t检验进行。c、d，G2停止的U2OS细胞的代表图像（c）和量化（d），这些细胞转染了指示的siRNA并按a中的方法染色端粒和中期粒及EdU。统计分析使用一元ANOVA与Dunnett事后检验进行多重比较。e，代表性FISH染色显示HeLa（TERT +）和U2OS（ALT +）的中期染色质中的端粒和CENP-B盒。星号表示端粒上的CENP-B盒信号。f，端粒上重叠CENP-B盒（左）或α-sat（右）信号的量化。数据显示为三次和两次独立实验的均值±标准误。P值使用无配对的双尾t检验计算。g，所有Telo-seq读数中每个细胞系的17-bp α-sat基序与≤1个错配的频率。h，密度图（每个箱子的基序；y轴）显示在500-