主要内容：视网膜母细胞瘤蛋白是一种肿瘤抑制因子，能够防止不受控制的细胞分裂。它通过与E2F转录因子结合并拮抗它们在基因启动子上的作用，从而强制G1期细胞周期停滞，阻止E2F靶基因的表达，而这些基因是S期进入所必需的。这种抑制由低磷酸化（‘活跃’）的Rb介导。在G1期，细胞周期依赖性激酶（CDKs），特别是CDK2、CDK4和CDK6，对Rb进行磷酸化。一旦Rb被高度磷酸化（‘失活’），它便释放E2F因子，驱动不可逆的S期承诺。许多癌细胞保留野生型Rb表达，选择性CDK抑制剂的开发使Rb成为一个关键的治疗靶点。选择性CDK抑制剂强制Rb低磷酸化，下调E2F靶基因并诱导G1期停滞。在临床上，CDK4/6抑制剂有效抑制Rb磷酸化和肿瘤增殖，成为HR+乳腺癌早期和晚期疾病的一线治疗基石。CDK2抑制剂在CDK2活性增加驱动的肿瘤中同样展现出希望。除E2F抑制外，低磷酸化Rb可能在染色质上具有更广泛的功能。前基因组时代的研究表明，活跃的Rb可以与其他转录因子相互作用以调节其活性。因此，药理学上激活的Rb不仅可以停止细胞分裂，还可能影响广泛的转录程序，从而影响治疗结果。尽管CDK4/6抑制剂得到广泛临床应用，持续Rb激活在癌症中的下游转录后果仍然定义不清。阐明这些影响可以增强CDK抑制剂的使用并阐明耐药机制。历史上，绘制全基因组Rb的染色质占用映射一直困难，因为与染色质免疫沉淀后 sequecing (ChIP-seq) 相关的技术挑战，特别是通常观察到的低信号噪声比。为解决这个问题，尝试使用外源表达的标记Rb，这种方法可能对内源Rb丰度的细胞周期依赖波动不敏感，并且容易受到标签导致的蛋白功能、染色质结合特异性和与非靶蛋白的交叉反应的伪影影响。此外，大多数先前的Rb ChIP-seq研究是在非转化细胞中进行的，因此未解决CDK抑制对癌细胞中Rb的染色质结合景观和转录活性的影响。药物激活的Rb在染色质上累积：为克服长期以来在Rb-染色质相互作用分析上的挑战，我们应用了使用核酸酶的目标下切割和释放（CUT&RUN），实现了对未标记的Rb进行高分辨率映射，而无需使用甲醛交联。利用经过验证的单克隆抗体，我们在HR+乳腺癌细胞系（MCF7和ZR-75-1）中优化了这一检测，生成了在等位基因RB1敲除细胞中缺失的显著Rb峰，确认了特异性。我们应用Rb CUT&RUN检测以检查CDK抑制如何改变Rb的染色质占用。在使用阿贝马西克利抑制CDK4/6后，两个细胞系均表现出Rb低磷酸化、Rb总水平降低和G1期停滞，符合预期。重要的是，基因组范围的分析显示染色质结合的Rb显著增加——在MCF7和ZR-75-1细胞中分别有15,218个和12,868个‘上峰’，仅有57个和8个‘下峰’，突显出尽管总蛋白水平降低，但低磷酸化、活跃的Rb仍显著重新分布在染色质上。这些观察通过另一个CDK4/6抑制剂帕博西尼得到了证实，并扩大到CDK2抑制的细胞周期E驱动的卵巢癌细胞系，表明其更广泛的相关性。图1：CDK4/6抑制驱动原生Rb在染色质上的全基因组重分布。Rb染色质结合通过在使用阿贝马西克利（abema）或DMSO处理的MCF7和ZR-75-1细胞中的CUT&RUN进行了分析，并通过DynaTag在应用阿贝马西克利或载体的乳腺癌PDX模型KCC-P-3837中进行分析。a，阿贝马西克利处理后Rb染色质结合的差异MA（减法平均）图。每个点代表一个400-bp基因组区域。通过使用DESeq2进行差异Rb结合的判定，同时应用Benjamini–Hochberg多重检验校正；橙色表示调整后的P < 0.1的区域用于细胞系，调整后的P < 0.2用于PDXs；水平虚线表示log 2（折叠变化）= 0。b，显示在a中识别的Rb结合增加的区域（上峰）的基因组分布。UTR，非翻译区。c，在b中定义的上峰区域的Rb信号的复合轮廓和热图。每一行代表一个基因组区域；颜色表示信号强度。AU，任意单位。