体外转录（IVT）的mRNA已经发展成为一个多功能的治疗平台，正如mRNA基础的COVID-19疫苗所示，能够编程使细胞表达免疫原性病毒蛋白1，6。为了增强稳定性和翻译，合成mRNA的5'端加盖N 7 -甲基鸟苷，3'端加上多腺苷酸化7。与内源性转录本不同，内源性转录本直接被转运到细胞质中，IVT mRNA则通过内涵体途径进入细胞，这会激活先天免疫传感器。该过程会诱导I型干扰素反应和eIF2α磷酸化（p-eIF2α），这会促进RNA降解和整体翻译抑制6。在体外转录过程中均匀地包含改性核苷三磷酸（NTPs）可以减轻免疫检测，提高mRNA的稳定性和蛋白质输出1，6，8。然而，最近的研究发现，当前行业标准的m 1 Ψ会妨碍翻译的准确性，从而产生不必要的新抗原3，9。这些观察强调了需要替代或补充策略，以优化mRNA治疗的安全性和有效性。在约170种已知RNA修饰中，只有一小部分被评估用于mRNA治疗应用7，10。我们之前展示了天然存在的修饰ac 4 C能够显著增强HeLa细胞中IVT mRNA的翻译11。从机制上讲，ac 4 C稳固了与鸟苷的沃森-克里克碱基配对，这增强了与相应tRNA的相互作用并促进RNA二级结构的形成12。总体效果是对翻译的依赖于位置的调节。在编码序列（CDS）中，ac 4 C通过改进tRNA-mRNA解码效率来促进翻译延长11。相反，在5'非翻译区（UTR）中，ac 4 C通过形成妨碍核糖体扫描的结构来抑制翻译起始11，13。值得注意的是，作为一种胞苷修饰，ac 4 C本质上被排除在起始和终止密码子之外，这些位置的核苷酸修饰可能会干扰起始和终止13，14。有鉴于此，我们研究了将ac 4 C与行业标准的m 1 Ψ一起纳入IVT mRNAs的效果。此外，我们还评估了已经在mRNA治疗中探索过的伪尿苷（Ψ）和5-甲基胞苷（m 5 C）2，8。ac 4 C增强IVT mRNA翻译，一个编码优化UTR的DNA模板包围生物发光NanoLuciferase（NanoLuc）的CDS，进行了IVT，ac 4 C或m 5 C被替代为胞苷，或者Ψ或m 1 Ψ替代为尿苷（图1a和补充表1）。所有mRNA均在转录过程中加盖和多腺苷酸化。为了避免ac 4 C对翻译起始的抑制效应，IVT模板设计为无C的5'UTR，保留Kozak序列，从而将ac 4 C限制在CDS内13。用典型的NTPs进行的体外转录作为未修饰的对照。RNA完整性、产量和加盖效率得到了验证（扩展数据图1a-c）。图1：ac 4 C增强IVT mRNA翻译。a，IVT mRNA生产和转染的示意图。b - f，NanoLuc转染进入HeLa细胞后的翻译。b，NanoLuc mRNA水平在t = 0时（5分钟），和RPS16归一化。NT，未转染。c，转染后指定时间的NanoLuc mRNA衰减。d，指定时间的NanoLuc发光。RLU，相对光单位。e，转染后6小时指定蛋白质的代表性免疫印迹，以β-微管蛋白作为装载对照。f，转染后6小时的IFNB1 mRNA水平，以polyI:C（pI:C）作为阳性对照。n = 3；与未修饰mRNA进行的面积下的曲线（AUC）比较的双尾未配对学生t检验（c，d）。g - i，转染G47A+884G突变T7衍生的IVT mRNA后在HeLa细胞中的NanoLuc翻译。g，转染和洗脱5分钟后的mRNA水平。h，在指定时间的发光。i，转染后6小时的Western blot。n = 3；双尾未配对学生t检验（h）。j - l，转染IVT mRNA后在HeLa细胞中的NanoLuc翻译。j，电穿孔后立即的mRNA水平。k，6小时的发光。l，转染后6小时的免疫印迹。n = 3；与ac 4 C修饰的mRNA进行的双尾未配对学生t检验（k）。m - o，NanoLuc在RRL中的翻译。m，mRNA水平归一化为时间为零。n，在指定时间的发光。o，80分钟时蛋白质的代表性免疫印迹。n = 3；与未修饰mRNA在AUC上进行的双尾未配对学生t检验（n）。p - t，转染IVT mRNA后在HeLa细胞中的CD25翻译。p，转染和洗脱5分钟后的mRNA水平。q，转染后指定时间的免疫印迹（IB）。r，s，通过流式细胞术在6小时检查所有细胞的表面表达（r）和CD25高分数（s）。t，经过延长转染后随时间的表面表达。n = 3；双尾未配对学生t检验。NS