自2022年以来，猴痘病毒（MPXV）影响了140多个国家，并导致超过179,000例实验室确诊病例。最近一波感染是由Ib变体引发，证据表明人际传播持续存在并全球扩散。另一种痘病毒是天花病毒，造成了人类历史上最具破坏性的疾病之一，直到其被消灭。痘病毒在宿主细胞的胞质中复制。它们的基因组编码DNA复制和基因表达所需的蛋白质，并具有不完全配对的发夹环连接两个DNA链的倒置末端重复，使其形成持续的多核苷酸链。复制病毒基因组的蛋白质包括DNA聚合酶（F8，A22和E4）和六聚体解螺旋酶-引物酶E5。痘病毒的DNA聚合酶属于B类DNA聚合酶，其催化亚基F8包含经典的指头、掌和拇指结构域、N末端结构域（NTD）和3′–5′校对外切酶（Exo）结构域。F8的外切酶活性还促进了病毒基因重组。在组装的聚合酶全酶中，A22作为桥梁连接F8和E4。病毒解螺旋酶-引物酶E5的N末端区域包含一个引物酶结构域，其酶活性对病毒DNA复制至关重要。E5的C末端区域包含一个超家族3解螺旋酶，并形成一个带有中心通道的六聚体环，用于单链DNA（ssDNA）在3′–5′方向的转运。单链DNA结合蛋白I3对病毒复制也是必不可少的，病毒DNA或宿主DNA连接酶同样重要。之前对全长MPXV E5的研究表明，除非删除引物酶结构域，否则其活性较弱。E5的结构显示引物酶结构域会阻塞E5的ssDNA通道，暗示存在自我抑制的构象。E5如何从自我抑制构象过渡到活化状态尚不清楚。在这里，我们确定了DNA结合的MPXV E5解螺旋酶-引物酶与DNA聚合酶全酶复合体的冷冻电镜（cryo-EM）结构。我们使用生化检测和单分子实验表明，当E5与聚合酶相互作用时，发生的构象变化导致解螺旋酶的激活，并增强了E5的引物酶活性。MPXV复制体的组装我们在短暂转染的哺乳动物细胞中纯化了E5（残基1–785）和聚合酶全酶（F8，残基1–1006；A22，残基1–426；E4，残基1–218）。在使用质量光度法（MP）检查时，聚合酶样本中有相当一部分颗粒与组装的全酶（F8–A22–E4）异源三聚体一致，其预期质量为191 kDa（MP测量为193，标准差为±14.5 kDa）。我们还观察到一个较小的峰，可能代表之前研究中也观察到的F8、A22和E4的自我抑制二聚体。图1：MPXV复制体的冷冻电镜结构。a，MPXV E5、F8、A22和E4的结构域架构。对于E5原体，虚线框表示可能由于灵活性无法解析的区域。CTD，C端结构域；NTD，NH2端结构域；F，指头结构域。b，纯化后用SEC可视化的的MPXV E5与聚合酶和DNA（模板1）复合物的SDS-PAGE分析，使用无染胶系统。星号表示可能代表降解的蛋白质产物或污染物的带。实验重复了三次；展示了一张代表性胶体。c，SEC纯化的E5与聚合酶和DNA（模板1）的MP分析。726 kDa的峰可能代表MPXV复制体；538 kDa的复合物与E5六聚体一致；195 kDa的峰可能对应聚合酶全酶；87 kDa的峰可能对应A22–E4亚复合物；而52 kDa的峰可能是A22单独存在。更多信息请参见补充表1。该实验重复了两次（n = 2）；显示了代表性数据。d，e，MPXV复制体与ssDNA结合的复合冷冻电镜图（d）和带状图（e）。整体图的分辨率为4.1 Å；复合图由集中于解螺旋酶（3.8 Å）和与引物域结合的聚合酶（3.5 Å）的图组成，后处理使用了DeepEMhancer。在e中，E5 F ZBM和E5 F RRM的连接显示，但由于密度较差未在最终坐标中存放。f，MPXV复制体与叉状DNA结合的复合冷冻电镜图。整体图的分辨率为6.5 Å；复合图由集中于解螺旋酶（4.5 Å）和与引物结合的聚合酶（4.1 Å）的图组成，后处理使用了DeepEMhancer。聚合酶亚单位的着色与e中一致，E5解螺旋酶结构域以灰色显示。E5形成的六聚体与此一致。