主要合成的基因密码1、2、4、5使得构建具有新特性的生物体成为可能，例如增强的病毒抗性和降低的横向基因转移2、9、10，以及生产基因编码的材料11、12、治疗药物13和生物催化剂14。通过使用工程化的核糖体15、16、17、tRNA18和aaRSs18、19，基因密码扩展使得在活细胞中将超过400种非标准氨基酸（nsAAs）引入蛋白质20和合成序列定义的聚合物21、22、23成为可能。然而，对于整个基因组3、6重新指派超过少数感码子仍是一个挑战，如何将多个nsAAs高纯度地引入多肽中也是如此。为了实现从遗传序列空间到序列定义的化学的完全控控制，需要对翻译系统进行更加激进的重新设计。考虑到基因组合成与编辑的挑战，一个完全自动化的工作流程用于设计和测试新的基因密码可以加速基因组工程，推动基因组超越自然进化的范围，并允许前所未有的对序列定义聚合物合成的控制（图1a）。将64个密码子近乎通用的基因代码压缩到仅20个感码子、一个起始密码子和一个终止密码子，释放了14个密码子用于非标准构建块（图1b和扩展数据图1）。我们预测了一个模块化的、自动化的、数据驱动的重新设计周期。通过将定制的裂解液基础翻译系统与携带工程抗密码子的合成tRNA库结合，我们可以快速原型替代基因密码并评估其在多肽合成中的性能（图1a）。图1：AGENTEX使基因密码和序列定义生物聚合物合成的多重测试成为可能。a，含有G2251C和G2553C突变的大的核糖体亚单位（CGA核糖体）专门适应具有3’ CGA末端的tRNA（otRNA）并且不接受自然tRNA进行翻译。自然的aaRS可以在一锅反应中氨基酸化所有otRNA，允许它们在翻译中使用。通过裂解包含CGA核糖体的细胞，生成无细胞翻译系统（裂解液），并在自动化工作流程中用于后续翻译测试。每一个基因密码作为otRNA的池合成，这些otRNA通过机器人生产并引入裂解液。例如，可以提供每种氨基酸的单个tRNA，从而生成压缩的基因密码。类似地，用于多肽翻译的mRNA模板会自动合成和纯化，所有反应步骤都是自动化的。otRNA在裂解液中由aaRS持续氨基酸化，并与CGA核糖体特定相互作用，同时避免与自然翻译系统的交叉通话。每个基因密码的效果，在otRNA池的组成中指定，可以进行分析并用于快速生成下一个基因密码实验。该系统的构成确保了生物安全，因为AGENTEX的组件在转移到环境中的活生物体时是无功能的。b，压缩基因密码的设计。考虑到64个otRNA三联密码子和正常的摆动规则，20种典型氨基酸每种可以由单个tRNA解码，且有14个密码子可以重新指派，用红色标出。或者，所有34个密码子可以用于制造类似于非核糖体肽合成酶的肽，使用典型氨基酸和其他氨基酸的混合物。有关密码子选择和开放密码子设计的更多细节在扩展数据图1中提供。无细胞翻译平台分为裂解液衍生（裂解液）和PURExpress（PURE）系统。裂解液由粗细胞提取物生产，并保留翻译机制和RNA及翻译后修饰的酶24。PURE使用单独纯化的组分，包括核糖体、aaRS、tRNA和翻译因子，按照定义的比例组合25。裂解液为基因代码原型制作提供了几个优势，包括支持增强密码子-反密码子配对的天然tRNA修饰26、27，适用于生物生产的可扩展性24、28、29及与体内系统的相似性30。然而，裂解液还包含宿主的完整tRNA集，这可能与重新指派的感码子发生交叉通话，并且会掩盖合成基因代码设计。因此，概念验证基因代码扩展研究和定向进化主要是在PURE中进行31、32，尽管PURE不太适合用于准备规模的生物生产。为了克服这一限制，我们提议对所有tRNA的3' CCA序列与大肠杆菌核糖体的23S rRNA中的G2251和G2553之间的普遍Watson-Crick相互作用进行工程设计7、8，以确保在翻译过程中能够特异性地适应tRNA。先前在PURE中显示，含有G2251C和G2553C突变的纯化核糖体能够适应3' CGA末端的tRNA用于短肽的翻译33。