主要工程化的酶旨在提供新功能或改进功能的解决方案，解决生物医学研究、治疗方法、化学合成和环境科学中的问题3, 4。可以通过定向进化生成具有量身定制特性的酶，通常以自然蛋白质作为起点。噬菌体辅助的连续进化（PACE）是一种特别强大的蛋白质进化方法，因其能够每24小时在没有研究人员干预的情况下进行数十代的突变、选择和复制2, 5。PACE选择已被用于重新编程多种蛋白质的特异性，包括DNA结合域、抗体模拟物、降解标签和催化剂，包括聚合酶、氨基酰-tRNA合成酶、脱氢酶和蛋白酶2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12。PACE还产生了在哺乳动物细胞中具有强大基因编辑活性的可编程核酸酶、碱基编辑器、原菌编辑器、转座酶和重组酶7, 13, 14, 15, 16, 17。所有这些示例都是以编码自然蛋白的基因为起点进行进化的。尽管自然酶可以作为实验室进化的有效起点，但当支撑所需功能的突变导致过多的折叠或溶解缺陷时，定向进化实验往往会遇到困难18, 19, 20, 21。大多数野生型蛋白质的稳定性边际22, 23，且由于大多数突变具有不稳定性，积累突变以获得新特性的进化蛋白质往往会失去稳定性24, 25, 26。因此，蛋白质能够从中调动的稳定性，以适应在失去折叠能力之前增加期望功能的突变，可以决定其进化潜力20, 27。为了获得新功能而牺牲稳定性，可能有助于解释为什么进化的酶在其新功能上的活性或特异性通常低于其野生型起点。尽管PACE和其他进化方法可以显著改变底物特异性，但在非天然底物上的进化催化效能通常低于其野生型酶在其天然底物上的效能10, 11, 28, 29。重新编程的酶也可能在不希望的天然底物上保留活性10, 11, 13。自然进化及实验室进化实验的观察已揭示出一些例子，其中酶必须先进化出更高的稳定性，然后才能在新底物上进化出活性20, 30, 31。那些在进程中进化出期望功能但失去稳定性的蛋白质，通常需要额外的工程技术来恢复足够的稳定性才能有效使用21。增加天然酶进化潜力的一种方法是，首先进化酶以提高热稳定性或可溶性表达，然后利用稳定化的蛋白质作为进化期望特性的起点32, 33。这种工作流程需要额外 substantial 的时间和劳动力来实现稳定性的实验进化，此外还需要进化期望活性。此外，在可溶性表达进化中，同时选择保留功能的执行是极具挑战性的，同时又要缓解作弊现象，即蛋白质表达与报告蛋白表达和激活脱钩32。研究人员还通过在进化过程中过表达分子伴侣来挽救降解的稳定性，但在没有伴侣的情况下，所得到的进化基因型可能表现不佳19。我们假设计算蛋白设计可以克服上述使用自然蛋白作为定向进化起点的局限。基于机器学习的方法在酶的去新设计中迅速进展34, 35, 36。然而，去新设计的酶通常在催化速率上被其天然同类所超越，目前的设计方法需要源自自然酶的活性位点或通过量子力学预测的活性位点36。机器学习模型以及物理建模成功地重新设计了自然蛋白的序列。基于神经网络的ProteinMPNN和基于物理能量的方法PROSS在保留各种折叠和功能的蛋白质的天然功能的同时改善了蛋白质的稳定性1, 37, 38。我们寻求探讨实验室进化的酶是否可以通过计算方式重新设计，以恢复进化过程中失去的稳定性，并确定稳定性重新设计的酶是否作为实验室蛋白质进化的更优起点。令人鼓舞的是，最近的一项报告展示了一种序列重新设计的Fe(II)/αKG超级家族酶在离散筛选中能比野生型酶进化出更高的羟化酶活性39。然而，序列重新设计的酶在不同底物上的进化能力以及多种起始活性和物理化学特性尚未被报道。更一般地说，序列重新设计如何修改经过多代实验室进化的广泛适应度景观