主要的安格尔曼综合症 (AS) 在每 20,000 次出生中发生 1 次，特点是智力障碍、发育迟缓、癫痫、小头畸形、畸形面部特征以及独特的行为特征。它是由于母体遗传的 UBE3A 基因的缺失或突变引起的，该基因也与情绪障碍、自闭症和癌症相关。普遍接受的观点是，AS 中的表型是由于发育过程中 UBE3A 底物的失调引起的。然而，尽管已提出了许多底物，但建立它们与 AS 表型的联系一直很困难，这限制了研究人员对该疾病的机制理解。UBE3A 是 HECT（与 E6-AP C 末端同源）结构域家族的创始成员，该家族的所有成员都具有一个保守的 HECT 结构域，该结构域包含必要的生化机制来接受来自 E2 酶的活化泛素并将其转移到靶蛋白上。UBE3A 表达在神经元中具有印记特征，只有母体遗传等位基因被表达，而父亲遗传的等位基因在表观遗传上被沉默。该印记机制以及许多与疾病相关的表型在缺失母体 Ube3a 副本的 AS 模型小鼠中得以保持。这些表型包括运动和行为缺陷，以及小头畸形，这是 AS 中最突出的神经解剖缺陷。小头畸形在小鼠出生时并不存在，但在出生后获得，由神经元生长的失败驱动，导致树突树状突起更短、更简单和直径更小的轴突。综合应激反应（ISR）是一个保守的途径，有助于在应对有害刺激时维持细胞的稳态，包括蛋白毒性压力、营养摄入不足、病毒感染和氧化压力。这些刺激由四种专门的激酶（PERK、GCN2、PKR 和 HRI）感知，它们汇聚到真核翻译起始因子 2 的 α 亚基的磷酸化（p-eIF2α），以抑制全局蛋白质合成并启动补偿转录程序。天冬酰胺合成酶（ASNS）是一种保守的代谢酶，在氨基酸摄入不足时由 ATF4 转录因子诱导。ASNS 催化 ATP 依赖的天冬酰胺和谷氨酸从天冬氨酸和谷氨酰胺的合成，但其在神经元发育中的作用仍然很少理解。蛋白质组学鉴定 UBE3A 底物为鉴定 UBE3A 的底物，我们使用表达功能获得突变 (GOF) 和失去功能突变 (LOF) 的细胞系，并通过细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记（SILAC）、胰蛋白酶残基免疫亲和富集（di-Gly 纯化）和质谱分析进行了实验。我们进行了四次重复实验，识别出在表达 UBE3A 的超活化突变的细胞中，泛素化水平至少增加了 20% 的蛋白质。由于该实验中的技术问题（详情见方法），检测到的蛋白质总数在重复实验中有所不同。然而，通过比较重复实验中的独特蛋白，允许我们编制一个包含 23 种蛋白的潜在底物列表。在此列表中，有新的底物，以及许多已知与 UBE3A 结合或被 UBE3A 泛素化的蛋白。图 1：基于变异的 UBE3A 底物的发现。a ，在表达 LOF 或 GOF 突变的 HEK293T 细胞中的 SILAC 工作流程示意图。b ，韦恩图显示液相色谱-串联质谱分析中识别的蛋白数量。进行了四次重复实验的比较识别出 23 种共同底物（n = 4 生物重复）。c ，在我们的筛选中识别出的假设 UBE3A 底物及其基因名称列表。绿色表示已知的 UBE3A 底物或相互作用蛋白；加粗表示通过二次验证确认的底物。d ，e ，转染 WT MYC-UBE3A 或 MYC-UBE3A(LD) 的 HEK293T 细胞候选蛋白的西方印迹和定量。数据为均值 ± 标准误差。通过双侧单向方差分析（ANOVA）和 Tukey 多重比较检验来确定显著性。确切的 P 值已显示。f ，韦恩图显示本研究中识别的假设底物与在 HEK293T 细胞中与 UBE3A 共免疫沉淀的蛋白之间的重叠。g ，韦恩图显示从两条来源于诱导性多能干细胞的 AS 神经元中通过质谱分析识别出的上调蛋白中提出的 UBE3A 底物。完整的蛋白质概况显示在补充表 2 中。所有样本数量（n）代表独立的生物重复：b 中 n = 4，e 中 n = 3 (ASNS) 和 n = 4 (DNA-PKc)。源数据为了验证这些候选者，首先我们通过 HEK293 细胞的西方印迹分析比较了蛋白质丰度。