主要的细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs) 控制真核细胞周期的通过。WEE1 (参考文献 4) 是一种酪氨酸激酶，通过磷酸化 Tyr15 抑制 CDK1 (参考文献 1, 2, 3)。在 G2 期末，CDC25 脱磷酸酶去磷酸化 Tyr15，促进有丝分裂进入 (参考文献 1, 5, 6, 7, 8)。该机制形成了一个 G2 DNA 损伤检查点，这在 TP53 突变的癌细胞中变得至关重要 (参考文献 9)。因此，开发了 WEE1 抑制剂 (WEE1i) 以在 TP53 突变癌中实现合成致死，并正在多个适应症中进行试验 (参考文献 10, 11)。然而，未知来源的毒性副作用 (参考文献 11) 导致试验暂停。WEE1 还抑制 CDK2，这是 G1/S 进展和增殖承诺的重要驱动因子。一致性地，不能磷酸化的 CDK2 T14A;Y15F 基因敲入小鼠和人类结直肠癌细胞在从静止状态返回周期时进入 S 期更快 (参考文献 12, 13)。然而，目前没有 WEE1 对 CDK2 影响的直接细胞证据 (参考文献 14)，而在 IMR90 人类成纤维细胞中外源性 WEE1 表达对 G1/S 时间没有影响 (参考文献 15)。因此，我们寻求澄清 WEE1 在早期细胞周期控制中的功能。我们证明 WEE1 在抑制与 CDH1 结合的后期促进复合物–细胞周期体 (APC/C CDH1) 中发挥作用，这是 G1/S 进展的一个关键拮抗因子，以促进在释放静止后及时重新进入细胞周期。我们将 CDH1 (FZR1) 识别为与细胞周期控制相关的 WEE1 底物。我们的发现揭示了 WEE1i 在细胞中的多效性影响。WEE1 促进高效的 S 期进入为了理解 WEE1 在 G1 和 S 期进入期间调节 CDK2 活动的潜在作用，我们构建了一个影响图，描述 WEE1 与 G1/S 监管网络的已知相互作用 (图 1a)。WEE1 抑制细胞周期蛋白 E–CDK2 和细胞周期蛋白 A–CDK2 (参考文献 16)。我们将该影响图转换为一系列常微分方程，并参数化模型以重现 G1/S 监管网络的已知动态 (图 1b)。我们模拟了 WEE1 水平减少到基线的 50%，观察到 CDK2 早期激活，S 期进入速度比 100% WEE1 活性时更快。图 1：WEE1 促进有效的 S 期进入。a，G1/S 监管网络的影响图。b，常微分方程模型的时间进程模拟，展示了将 WEE1 活性降低到 WT 水平的 50% 预测 CDK2 活性更快增加和更短的 G1 期。细胞周期蛋白 E 总量指 Tyr15 磷酸化（不活跃）和 Tyr15 去磷酸化（活跃）的 CDK2 结合（蓝色虚线曲线），而细胞周期蛋白 E 仅是 Tyr15 去磷酸化的 CDK2（活跃，蓝色实线曲线）。相同的逻辑适用于绿色的细胞周期蛋白 A。G1/S 转变用灰色虚线标记，由 APC/C CDH1 关闭时间（红色实线曲线）和细胞周期蛋白 A–CDK2 的增加来决定。c，WEE1i 处理后在从 CDK4/6i 媒介的 G0/G1 arrest 释放后的 G1 期长度（左）和没有进入 S 期的细胞比例（右）。d，WEE1 用 siRNA 除去后在从 CDK4/6i 媒介的 G0/G1 arrest 释放之后的 G1 期长度（左）和没有进入 S 期的细胞比例（右），在释放前 6 小时处理。e，WEE1 通过添加多西环素（Dox）和 IAA 降解后的 G1 期长度（左）和没有进入 S 期的细胞比例（右），在释放后来自 CDK4/6i 媒介的 G0/G1 arrest。c-e 中，实验时间线显示在图表上；所有实验涉及 n = 2 生物重复；均值 ± 标准差用黑线绘制；单个数据点用蓝色或灰色显示，以实验重复着色。显著性通过非配对学生 t 检验确定；**** P < 0.0001，** P < 0.01。源数据为了实验测试在减小 WEE1 活性时我们是否能观察到加速的 S 期进入，我们使用了 AZD1775，这是一种在临床试验中使用的 WEE1i（扩展数据图 1a-c）。为了在避免前 G2 期 WEE1 干扰的情况下研究 WEE1 在 S 期进入中的作用，我们使用 CDK4-CDK6 抑制剂 (CDK4/6i) 将 hTert-RPE1 mRuby–PCNA 细胞同步在早期 G0/G1 期（扩展数据图 1d）。在内源性基因座用 mRuby 标记的 PCNA 生成一个强稳健的标记，以定义 G1/S 转变（方法）。随后，我们冲洗 CDK4/6i，释放细胞进入 G1，存在或不存在 WEE1i，并通过时间推移成像 mRuby 标记的 PCNA 来量化 G1 长度（扩展数据图 1e）。与我们的模型预测相反，WEE1 抑制在 48 小时成像期间增加了 G1 长度和没有进入 S 期细胞的比例（图 1c）。为了确认这不是 CDK4/6i 处理的伪影，我们还通过接触抑制将细胞 arrested 在 G0，然后进行血清饥饿（扩展数据图 1f），然后以低密度重新接种细胞，释放细胞进入...