主要内容：大脑皮层是认知脑功能的核心，由大量多样的神经元和胶质细胞组成。神经干细胞（NSCs），包括RGP细胞及其相关细胞谱系，生成并组成所有主要的新皮质投射神经元类别及大胶质细胞。使用MADM进行的系统性克隆分析在单细胞水平上的原位研究，提供了RGP谱系在小鼠体内进展的首个定量和时间刻板框架。初生的RGP最初经历对称增殖分裂，扩展它们的细胞池。在可预测数量的增殖分裂之后，并在特定的发展阶段，RGP转变为不对称的神经发生分裂。小鼠中的RGP以8-9个神经元的单位生成投射神经元，其中出生顺序决定了细胞命运和层次位置。在神经发生后，一部分RGP获得胶质发生潜力，产生星形胶质细胞和少突胶质细胞。RGP谱系进展以严格线性方式进行，具有顺序、基本不重叠和连续的发展时间框架。忠实的RGP增殖行为和谱系进展对于生成正确大小和细胞类型多样性的大脑皮层至关重要。指示RGP谱系转变的基本原则及其时间上的神经发生或胶质发生潜力仍然未知，尽管细胞内源性的表观遗传和遗传线索似乎是关键。事实上，皮层前体细胞和经过程序化以生成皮层谱系的小鼠胚胎干细胞在孤立的细胞培养中重演有限的RGP谱系模式，因此在缺乏内源性干细胞生态位的情况下。此外，最近在体外重建胚胎发育主要阶段的进展表明，自我组织原则对所有三 germ层的多能胚胎干细胞谱系进展是足够的。在这里，我们特别关注皮层类器官系统，其中自我组织似乎是构建皮层结构的主要驱动因素，所有主要细胞类型均来自一组胚胎NSCs，紧密重演发育过程和特定于皮层组织的特征。然而，是否以及如何自我组织可以指导承诺的多能前体细胞，并协调有时间刻板的NSC谱系进展，以产生忠实的定量和定性后分裂细胞命运及细胞类型多样性仍不明确。在这里，我们利用真实单细胞分辨率的谱系追踪研究在体外类器官系统中神经发生RGP增殖行为。我们发现，在自我组织的皮层类器官中，RGP谱系进展在某些特定方面与RGP细胞谱系线性、时间刻板的体内进展概念形成对比。因此，真正的干细胞生态位似乎对RGP谱系进展的忠实时间控制和在克隆水平上生成皮层细胞类型多样性至关重要。类器官建模体内发育：为了建立一个能够研究Emx1 + RGP及其整个前景标记谱系群的体外系统，我们设想了一种遗传策略，以在分化的皮层类器官中靶向Emx1 +谱系（产生绝大多数、如果不是全部情况下皮层兴奋性神经元和大胶质细胞）(图1a，b)。我们首先将Emx1-cre驱动子与mTmG报告系统交配，以在tdTomato（tdT）背景下标记所有来自Emx1 +谱系的细胞（即所有Emx1 -细胞），在E3.5时分离mTmG +/− ; Emx1 cre/+ 胚泡，并衍生出mESCs。使用多能性标记物（OCT3/4和NANOG）进行的免疫组化和G带核型分析定性验证了新建立的mESC系（补充图1）。接下来，我们生成了mTmG +/− ; Emx1 cre/+皮层类器官，在分化第8天(D8)、D13、D20和D25的时间过程中分离样本（图1b–f），并对样本进行10X FLEX单细胞RNA测序（scRNA-seq）（两个独立细胞系和两个批次；方法）。图1：小鼠皮层类器官系统在转录单细胞水平上重演了体内皮层生成的主要方面。a，使用mTmG报告系统和Emx1-cre驱动子对皮层Emx1谱系进行永久性标记的遗传策略。b，示意图说明实验scRNA-seq方法在转录水平追踪RGP谱系进展。携带mTmG报告系统和Emx1-cre转基因的小鼠交配生成mTmG +/− ; Emx1 cre/+胚胎（上）和胚泡（下）以供后续处理（方法）。B27，B27补充剂；FBS，胎牛血清；KSR，敲除血清替代品；N2，N2补充剂。c-f，mTmG的广角图像