数据可用性 本研究生成的原子坐标和结构因子已通过RCSB蛋白质数据银行公开获取，登录号为9YNL、9YNM、9YOX、9YOY、9YOZ和9YP0。支撑图1 – 5和扩展数据图1 – 10的原始数据随本文提供。作为计算输入或结构参考的可公开获取的结构是通过RCSB蛋白质数据银行获得的，登录号为1EUV、1TL9、1ATK、8A4V、1NQC、1ME3、3BPF、1BP4、1CVZ和1PPN。蛋白质序列在补充表1中提供，完整的质粒DNA序列在补充信息1和2中提供。代码可用性 用于计算设计和分析的代码在GitHub上公开可用（https://github.com/hojaec/RFD2_MI_cysteine_protease_pipeline）。用于生化动力学数据和哺乳动物细胞图像分析的代码在GitHub上公开可用（https://github.com/hojaec/Cysteine-protease-data-analysis）。参考文献 Radzicka, A. & Wolfenden, R. 中性溶液中未催化肽键水解的速率及其与蛋白酶的过渡态亲和力。J. Am. Chem. Soc. 118, 6105–6109 (1996)。 Dyer, R. P. & Weiss, G. A. 通过蛋白酶工程来达到目标。Cell Chem. Biol. 29, 177–190 (2022)。 Otto, H.-H. & Schirmeister, T. 半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂。Chem. Rev. 97, 133–172 (1997)。 Carter, P. & Wells, J. A. 解剖丝氨酸蛋白酶的催化三联体。Nature 332, 564–568 (1988)。 Ménard, R.等。氧阴离子穴的电静态环境的改变在半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶中是可以容忍的。Biochemistry 34, 464–471 (1995)。 Verma, S., Dixit, R. & Pandey, K. C. 半胱氨酸蛋白酶：激活模式及未来作为药理靶点的前景。Front. Pharmacol. 7, 107 (2016)。 Lauko, A. 等。丝氨酸水解酶的计算设计。Science 388, eadu2454 (2025)。 Kim, D. 等。金属水解酶的计算设计。Nature 649, 246–253 (2026)。 Ahern, W.等。使用RFdiffusion2进行原子级别酶活性位点支架构建。Nat. Methods 23, 96–105 (2026)。 Bauer, M. S.等。去新设计磷酸酪氨酸肽结合剂。预印本于bioRxiv https://doi.org/10.1101/2025.09.29.678898 (2025)。 Mossessova, E. & Lima, C. D. Ulp1-SUMO晶体结构和遗传分析揭示了保守相互作用和对酵母细胞生长至关重要的调节元件。Mol. Cell 5, 865–876 (2000)。 Dauparas, J.等。基于深度学习的蛋白质序列设计的稳健性。Science 378, 49–56 (2022)。 Abramson, J.等。使用AlphaFold 3对生物分子相互作用进行准确的结构预测。Nature 630, 493–500 (2024)。 Bindels, D. S.等。mScarlet：一种用于细胞成像的亮单体红色荧光蛋白。Nat. Methods 14, 53–56 (2017)。 Matayoshi, E. D.等。用于通过共振能量转移检测逆转录病毒蛋白酶的新型荧光基质。Science 247, 954–958 (1990)。 Hofer, F.等。天冬氨酸、半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶的催化位点pKa值：恒定pH分子动力学模拟。J. Chem. Inf. Model. 60, 3030–3042 (2020)。 Zhai, X. & Meek, T. D. 从稳定态和预稳定态动力学的方法确定克鲁扎因的催化机制。Biochemistry 57, 3176–3190 (2018)。 Daniel, R. M. & Danson, M. J. 对温度如何影响酶的催化活性有了新的认识。Trends Biochem. Sci 35, 584–591 (2010)。 Xu, Z.等。SUMO蛋白酶的氧化还原调控的分子基础：对不可逆巯基氧化的保护机制。FASEB J. 22, 127–137 (2008)。 van Kempen, M.等。利用Foldseek快速且准确的蛋白质结构搜索。Nat. Biotechnol. 42, 243–246 (2024)。 Zhang, Y. & Skolnick, J. 用于自动评估蛋白质结构模板质量的评分函数。Proteins 57, 702–710 (2004)。 Anishchenko, I.等。使用PLACER对蛋白质-小分子构象集合建模。Proc. Natl Acad. Sci. USA 122, e2427161122 (2025)。